WB即Western Blot，蛋白質(zhì)免疫印跡。是一種基于抗原抗體的特異性結(jié)合，半定量檢測樣品中某種蛋白的技術(shù)。作為分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種經(jīng)典實驗方法，WB雖看似簡單，卻常因各種因素做不出好看的結(jié)果圖，甚至拿不到結(jié)果。今天，小翌就帶領(lǐng)大家從頭開始，一整個過一遍超詳細(xì)的實驗流程，保管你一學(xué)就會，結(jié)果圖好看的讓人敬佩！
完整的WB流程，如下圖所示，包含樣本制備、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合、蛋白檢測5個大步驟。
翌圣為您提供Western Blot實驗整體解決方案，相關(guān)產(chǎn)品選購請參考：WB實驗系列產(chǎn)品-選購指南。
樣品制備
蛋白提?。ㄒ訰IPA裂解液為例）
1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF（Cat#20104ES），使PMSF的最終濃度為1 mM。
2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS（Cat# 60158ES）、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。細(xì)胞充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
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懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必須分裝成0.5-1×106個細(xì)胞/管，然后再裂解。
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組織樣本：按照每20 mg組織加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
3）充分裂解后，10000-14000 g離心3-5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#20156ES）打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。
相關(guān)產(chǎn)品詳情
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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RIPA lysis buffer (strong) RIPA裂解液（強(qiáng)） |
100 mL |
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RIPA Lysis Buffer (Medium) RIPA裂解液（中） |
100 mL |
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Lysis Buffer for WB/IP Assays 免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液 |
100 mL |
蛋白定量
1）配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進(jìn)行稀釋，配置成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品?；蛘吣梢赃x購BCA蛋白濃度測定試劑盒(即用型)（Cat#20200ES）該產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)配置好可以直接使用。
2）取25 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入到微孔板中。
3）每孔加入200 μL BCA工作液，振蕩30 s充分混勻。蓋上微孔板，37℃孵育30 min。
4）冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的540-595 nm波長范圍處檢測吸光度，其中562 nm波長為最佳。
5）根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度ug/mL；Y-最終的OD562 nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計算樣品蛋白濃度。
相關(guān)產(chǎn)品詳情：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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BCA Protein Quantification Kit BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型） |
500 T/2500 T/5000 T |
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BCA Protein Quantification Kit（Ready to use） BCA蛋白濃度測定試劑盒(即用型) |
500 T |
SDS-PAGE電泳
電泳凝膠可選擇SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、預(yù)制膠（Bis-Tris體系）三種。
以預(yù)制膠操作為例：
1）剪開包裝取出預(yù)制膠，撕去膠板底端深綠色膠帶，緩慢地拔出梳子，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿電泳緩沖液，外槽液體加入量要高于電泳槽高度1/3。可用移液槍或其他工具吸取電泳緩沖液輕輕吹打加樣孔，去除加樣孔內(nèi)殘留的儲存緩沖液和雜質(zhì)。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液（Cat#20315ES）。水浴溶解后立即室溫存放。
3）按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱 3-5 min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）在每個樣品孔中上樣10-30 μg蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，推薦150 V，跑50-70 min，通常電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳結(jié)束，取出凝膠，使用起膠器(Cat#80838ES)或其他合適的工具插入到膠板兩側(cè)之間的空隙中，慢慢的上下撬動上、中、下三個不同的位置，然后在另一側(cè)重復(fù)操作，直至膠板兩側(cè)完全打開。
7）膠板打開后，凝膠可能粘在膠板的任意一側(cè)，將有凝膠一側(cè)的膠板傾斜至水中，輕輕撥動凝膠，使凝膠自由掉落到裝有水的器皿中，晃動清洗凝膠，然后取出進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)膜實驗。
產(chǎn)品詳情
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（8-180 kDa） |
250 μL/2×250 μL/10×250 μL |
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三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-245 kDa) |
2×250 μL/10×250 μL |
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SDS-PAGE凝膠配置試劑盒 |
1 kit (30~50 gels)/ 1 kit (150~250 gels) |
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PAGE凝膠快速制備試劑盒 |
濃度：8%、10%、12.5%、15% |
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預(yù)制膠（Bis-Tris體系） |
濃度：8%、10%、12%、4-12%、4-20% 上樣孔數(shù)：10孔、12孔、15孔 |
轉(zhuǎn)膜與封閉
1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min。（如果檢測小分子蛋白質(zhì)，可省略該步驟，因小分子蛋白容易擴(kuò)散）。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2 min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。（膜的選擇：0.45 μm孔徑，用于一般蛋白；0.22 μm孔徑，用于分子量小于20 kD蛋白）
3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用滾輪或試管趕盡氣泡。
4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液（Cat#20329ES）中300 mA, 60 min轉(zhuǎn)膜處理，或使用快速轉(zhuǎn)膜液（Cat#36123ES）400 mA僅需15-35 min即可完成轉(zhuǎn)膜。
5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5 mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10 min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。注：如果沒有出現(xiàn)染色條帶，則表示轉(zhuǎn)膜失敗，可能需要重新轉(zhuǎn)膜或重新上樣電泳。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5 min。
8）脫色：將膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。
9）清洗：再用TBST清洗膜2~3次，每次5 min。
10）將膜置于25 mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時或使用快速封閉液（Cat#36122ES）處理10 min完成封閉。
11）用5 mL TBST（Cat#60145ES）洗滌三次，每次15 min。
產(chǎn)品詳情：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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0.45 μm PVDF 膜（1 卷, 30 cm x 3 m） |
1 卷 |
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0.22 μm PVDF 膜（1 卷, 30 cm x 3 m） |
1 卷 |
抗體孵育
1）將膜和一抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10 mL一抗稀釋緩沖液中在4ºC下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5 mL TBST洗滌三次，每次15 min以去除殘留的一抗。
3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10 mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5 mL TBST洗滌三次，每次15 min。
產(chǎn)品詳情：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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WB專用一抗二抗稀釋液 |
100 mL/500 mL |
蛋白檢測
1）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
2）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液（125 μL發(fā)光工作液/cm2膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3 min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。
3）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
4）在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
5）暗房內(nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。（從剛開始的10 s曝光時間中可以看出適當(dāng)?shù)钠毓鈺r間。由于檢測反應(yīng)的動力學(xué)特征，在孵育后信號立即變得最強(qiáng)，但在隨后的2小時內(nèi)會減弱）
產(chǎn)品詳情：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
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ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒 |
100 mL/500 mL |
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增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 |
100 mL/500 mL |
WB常見問題
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問題 |
可能原因 |
方案建議 |
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背景高：
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封閉不充分 |
更換使用新鮮的封閉液，適當(dāng)延長封閉時間。 |
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洗滌不充分 |
增加洗滌次數(shù)及時間，除去非特異結(jié)合。 |
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一抗?jié)舛冗^高 |
稀釋抗體至合適濃度。 |
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樣品有問題 |
檢查蛋白樣品的純度盒質(zhì)量，建議使用新鮮樣品。 |
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膜干燥 |
在孵育過程中防止膜變干，保證膜充分接觸反應(yīng)液。 |
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信號弱或完全缺失：
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轉(zhuǎn)膜不充分 |
檢查蛋白轉(zhuǎn)移的效率和時間是否正確。 |
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PVDF膜未激活 |
PVDF膜先浸泡在甲醇中激活，再轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜緩沖液中。 |
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一抗不識別檢測物種的蛋白 |
參考說明書，比對免疫原序列和蛋白序列以保證抗體和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照。 |
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一抗和二抗不匹配 |
檢查一抗和二抗的種屬：二抗需和一抗宿主的物種相同。 |
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沒有足夠的一抗和二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白 |
適當(dāng)增加抗體濃度，演唱4℃孵育時間（如過夜）。 |
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抗原量不足 |
每泳道蛋白上樣量不低于20-30 μg，試用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。 |
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組織中目的蛋白含量低 |
參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)靶標(biāo)蛋白是否在待檢組織或細(xì)胞中表達(dá)。如表達(dá)量較低，可以濃縮使信號最大或，同時增加高表達(dá)的陽性對照組，避免操作中出現(xiàn)問題。 |
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出現(xiàn)“非特異性”條帶、多帶等現(xiàn)象：
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細(xì)胞系傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化 |
使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系（不超過15代）進(jìn)行樣品制備。 |
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使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對照試驗。 |
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蛋白被降解 |
裂解液確保含有蛋白酶抑制劑，蛋白樣品提取后-80℃短期保存，避免反復(fù)凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。 |
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蛋白本身具有多種修飾形式 |
查閱文獻(xiàn)，確定目的蛋白是否存在多種修飾，如泛素化、糖基化等修飾會讓蛋白的條帶發(fā)生較大的偏移。 |
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所檢測蛋白存在多種剪接體，導(dǎo)致分子量大小不同 |
查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA。 |
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蛋白存在二聚體或多聚體 |
SDS loading buffer中現(xiàn)用現(xiàn)加β-巰基乙醇或DTT。 |
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樣本存在外源轉(zhuǎn)入蛋白 |
檢查所用樣本是否被轉(zhuǎn)入外援蛋白。如有，更換細(xì)胞系樣本。 |
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上樣量過多 |
根據(jù)靶標(biāo)表達(dá)情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常20-30 μg即可。 |
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靶蛋白形成多聚體 |
煮樣時，煮沸10分鐘，使蛋白質(zhì)解聚。 |
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一抗?jié)舛冗^高 |
一抗?jié)舛冗^高時常出現(xiàn)多條帶，需降低抗體濃度和/或孵育時間。 |
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二抗?jié)舛冗^高 |
高濃度會產(chǎn)生非特異性結(jié)合，需江都抗體濃度，增加二抗對照。 |
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檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白 |
查閱文獻(xiàn)報道，或BLAST搜尋，使用說明書推薦的細(xì)胞株或組織。 |
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若確保操作沒有問題，那么，您可能是發(fā)現(xiàn)了新蛋白！ |
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微笑條帶：
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遷移過快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質(zhì)超載或孔內(nèi)運行緩沖液不足 |
應(yīng)降低遷移速度、預(yù)冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內(nèi)室緩沖液不會泄露到外室 |
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皺眉條帶：
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裝置不合適，可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。 |
可通過調(diào)整裝置來避免該問題。 |
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條帶拖尾：
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樣品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；電泳液反復(fù)多次使用。 |
樣品充分溶解混勻后上樣；盡量使用新鮮樣本；使用新鮮配制的電泳緩沖液。 |
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啞鈴狀不均勻條帶：
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配置膠有問題，膠凝固后不均一；樣品可能含有過多雜質(zhì)。 |
重新配置膠，確保膠質(zhì)量無問題來避免該現(xiàn)象出現(xiàn)；在樣品使用前離心。 |
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條帶粘連：
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可能是上樣量太多，或者是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。 |
可通過減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來避免。 |
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條帶空泡：
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轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡 |
確保在組裝“三明治”時，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。 |
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背景有不均勻的黑色斑點：
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封閉液未完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時候膜上形成黑點；或抗體在膜上分布不均 |
封閉液一定要充分溶解，封閉結(jié)束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗體孵育時保持搖動。 |
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條帶空斑：
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可能是一抗二抗?jié)舛冗^高，促使底物過快消耗，導(dǎo)致在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光時，底物耗盡形成空斑。 |
降低一抗二抗?jié)舛?/font> |
翌圣為您提供Western Blot實驗整體解決方案，所有相關(guān)產(chǎn)品對比及選購請參考：WB實驗系列產(chǎn)品-選購指南
