Annexin V-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒是用綠色熒光染料FITC（Phycoerythrin）標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合?？赏ㄟ^細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯合使用。該染料不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可穿透晚期凋亡細胞或者壞死細胞并與其內的DNA結合。因此將Annexin V- FITC與7-AAD聯合使用時，7-AAD則被排除在活細胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Annexin V-FITC和7-AAD結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

 

產品信息

貨號	40311ES20 / 40311ES50 / 40311ES60
規(guī)格	20T / 50 T / 100 T
光譜特性	FITC：Ex/Em=488/525 nm；7-AAD：Ex/Em=546/647nm
適用設備	熒光顯微鏡；流式細胞儀

 

組分信息

組分編碼	組分名稱	40311ES20 (20 T)	40311ES50 (50 T)	40311ES60 (100 T)
40311-A	重組人Annexin V/FITC, (rh Annexin V/FITC)*	100 µL	250 µL	500 µL
40311-B	7-AAD Viability Staining Solution（20µg/mL）	200 µL	500 µL	1 mL
40311-C	4×結合緩沖液 (4×Binding Buffer )	4 mL	10 mL	20 mL

*來源于大腸桿菌（E.coli），分子量為35.8 KDa，純度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）

 

儲存條件

2~8℃儲存，勿冰凍。Annexin V-FITC、7-AAD需避光存儲。有效期1年。

 

使用說明

1. 樣品染色

1）懸浮細胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細胞。

貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2）配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結合緩沖液+12 mL 去離子水）。

3）用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min。

4）加入1×Binding Buffer重懸細胞，調節(jié)其濃度為1-5×10⁶細胞/mL。

5）取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。

6）加入10 μL 7-AAD（20µg/mL）。

7）加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時內檢測。

注意：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

2. 觀察檢測

流式細胞儀

1）用流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC的激發(fā)波長Ex=488nm，發(fā)射波長Em=525 nm，建議使用FL1通道檢測；7-AAD的激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm，發(fā)出紅色熒光，建議使用FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），FITC為橫坐標，7-AAD為縱坐標。每個樣采集10,000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅呈現很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅呈現較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞呈綠色和紅色熒光雙重染色。

2）熒光補償調節(jié)：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。

熒光顯微鏡

1）滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；

2）對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡；

a 將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；

b 用PBS洗滌細胞兩次；

c 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-FITC，5 μL 7-AAD染液混勻；

d 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

e 室溫避光孵育5 min。

3）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色；7-AAD熒光信號呈紅色。

 

注意事項

1.試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2.由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。

3.對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，7-AAD攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。

4.如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并低速離心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V結合緩沖液清洗細胞，以避免殘留的EDTA會螯合Ca²⁺。

5.7-AAD為潛在致癌物，操作時請采取防護措施，穿防護服、戴手套等。

6.Annexin V-FITC和7-AAD是光敏物質，在操作時請注意避光。

7.本產品僅作科研用途！本產品僅作科研用途！

 

Ver.CN20230618