產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號(hào)	規(guī)格	價(jià)格（元）
Annexin V- YSFluorTM 647/7-AAD Apoptosis Detection Kit Annexin V- YSFluorTM 647/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒	40312ES20	20 T	518.00
	40312ES50	50 T	1120.00
	40312ES60	100 T	1960.00

 

產(chǎn)品簡介

Annexin V-YSFluor^TM 647/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用熒光染料YSFluor^TM 647（Phycoerythrin）標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V- YSFluor^TM 647與7-AAD聯(lián)合使用時(shí)，7-AAD則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Annexin V-YSFluor^TM 647和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

 

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	40312ES20 / 40312ES50 / 40312ES60
規(guī)格	20T / 50 T / 100 T
光譜特性	YSFluorTM 647：Ex/Em=651/672 nm；7-AAD：Ex/Em=546/647nm
適用設(shè)備	流式細(xì)胞儀

 

組分信息

組分編碼	組分名稱	40312ES20 (20 T)	40312ES50 (50 T)	40312ES60 (100 T)
40312-A	重組人Annexin V-YSFluorTM 647, (rh Annexin V-YSFluorTM 647)*	100 µL	250 µL	500 µL
40312-B	7-AAD Viability Staining Solution（20µg/mL）	200 µL	500 µL	1 mL
40312-C	4×結(jié)合緩沖液 (4×Binding Buffer )	4 mL	10 mL	20 mL

*來源于大腸桿菌（E.coli），分子量為35.8 KDa，純度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）

 

儲(chǔ)存條件

2~8℃儲(chǔ)存，勿冰凍。Annexin V-YSFluor^TM 647、7-AAD需避光存儲(chǔ)。有效期1年。

 

使用說明

1. 樣品染色

1）懸浮細(xì)胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

2）配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結(jié)合緩沖液+12 mL 去離子水）。

3）用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min。

4）加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×10⁶細(xì)胞/mL。

5）取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-YSFluor^TM 647，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。

6）加入10 μL 7-AAD（20µg/mL）。

7）加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

注意：為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

2. 觀察檢測(cè)

流式細(xì)胞儀

1）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V- YSFluor^TM 647的激發(fā)波長Ex=651nm，發(fā)射波長Em=672 nm；7-AAD的激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），YSFluor^TM 647為橫坐標(biāo)，7-AAD為縱坐標(biāo)。

2）熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

熒光顯微鏡

1）滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；

2）對(duì)于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；

a 將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組；

b 用PBS洗滌細(xì)胞兩次；

c 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-YSFluor^TM 647，5 μL 7-AAD染液混勻；

d 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

e 室溫避光孵育5 min。

3）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

 

注意事項(xiàng)

1. 試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
2. 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
3. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，7-AAD攝入過多；消化時(shí)間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-YSFluor^TM 647的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
4. 如果樣品來源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴?/font>PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并低速離心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞，以避免殘留的EDTA會(huì)螯合Ca²⁺。
5. 7-AAD為潛在致癌物，操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴手套等。
6. Annexin V-YSFluor^TM 647和7-AAD是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。
7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！本產(chǎn)品僅作科研用途！

Ver.CN20240313