產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格	價格（元）
Annexin V- YSFluorTM 488/7-AAD Apoptosis Detection Kit Annexin V- YSFluorTM 488/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40313ES20	20 T	518.00
	40313ES50	50 T	1120.00
	40313ES60	100 T	1960.00

產(chǎn)品簡介

Annexin V-YSFluor^TM 488/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用綠色熒光染料YSFluor^TM 488（Phycoerythrin）標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V- YSFluor^TM 488與7-AAD聯(lián)合使用時，7-AAD則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被Annexin V-YSFluor^TM 488和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

 

產(chǎn)品信息

貨號	40313ES20 / 40313ES50 / 40313ES60
規(guī)格	20T / 50 T / 100 T
光譜特性	YSFluorTM 488：Ex/Em=495/519 nm；7-AAD：Ex/Em=546/647nm
適用設(shè)備	熒光顯微鏡；流式細(xì)胞儀

 

組分信息

組分編碼	組分名稱	40313ES20 (20 T)	40313ES50 (50 T)	40313ES60 (100 T)
40313-A	重組人Annexin V/YSFluorTM 488, (rh Annexin V/YSFluorTM 488)*	100 µL	250 µL	500 µL
40313-B	7-AAD Viability Staining Solution（20µg/mL）	200 µL	500 µL	1 mL
40313-C	4×結(jié)合緩沖液 (4×Binding Buffer )	4 mL	10 mL	20 mL

*來源于大腸桿菌（E.coli），分子量為35.8 KDa，純度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）

 

儲存條件

2~8℃儲存，勿冰凍。Annexin V-YSFluor^TM 488、7-AAD需避光存儲。有效期1年。

 

使用說明

1. 樣品染色

1）懸浮細(xì)胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2）配制1×Binding Buffer：用去離子水4倍稀釋4×Binding Buffer（4 mL 結(jié)合緩沖液+12 mL 去離子水）。

3）用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g，4 ℃離心5 min。

4）加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×10⁶細(xì)胞/mL。

5）取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-YSFluor^TM 488，輕輕混勻后于室溫避光孵育5min。

6）加入10 μL 7-AAD（20µg/mL）。

7）加入400 μL PBS Buffer，混勻，樣品在1小時內(nèi)檢測。

注意：為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

2. 觀察檢測

流式細(xì)胞儀

1）用流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-YSFluor^TM 488的激發(fā)波長Ex=495 nm，發(fā)射波長Em=519 nm，建議使用FL1通道檢測；7-AAD的激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm，發(fā)出紅色熒光，建議使用FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），YSFluor^TM 488為橫坐標(biāo)，7-AAD為縱坐標(biāo)。每個樣采集10,000 events。典型的實驗中，細(xì)胞可以分成三個亞群，活細(xì)胞僅呈現(xiàn)很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞呈綠色和紅色熒光雙重染色。

2）熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

熒光顯微鏡

1）滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；

2）對于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；

a 將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；

b 用PBS洗滌細(xì)胞兩次；

c 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-YSFluor^TM 488，5 μL 7-AAD染液混勻；

d 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

e 室溫避光孵育5 min。

3）將蓋玻片倒置于載玻片上，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-YSFluor^TM 488 熒光信號呈綠色；7-AAD熒光信號呈紅色。

 

注意事項

1. 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
2. 由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進(jìn)行分析。
3. 對于貼壁細(xì)胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，7-AAD攝入過多；消化時間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-YSFluor^TM 488的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。
4. 如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并低速離心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞，以避免殘留的EDTA會螯合Ca²⁺。
5. 7-AAD為潛在致癌物，操作時請采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴手套等。
6. Annexin V-YSFluor^TM 488和7-AAD是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

本產(chǎn)品僅作科研用途！本產(chǎn)品僅作科研用途！

Ver.CN20240313