外泌體曾經(jīng)被認(rèn)為是細(xì)胞卸載廢物的一種方式，在過去的十年中，我們對(duì)外泌體的看法發(fā)生了巨大變化。我們已經(jīng)開始認(rèn)識(shí)到，外泌體是從細(xì)胞中釋放出來的，通過其RNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和DNA的載體充當(dāng)信號(hào)載體和組織重塑者。參與癌癥，炎癥，免疫，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，心臟細(xì)胞功能。

外泌體在這些基本生物過程中的作用，它們作為生物標(biāo)志物，也可作為靶向遞送生物分子藥物載體（如治療）的工具研究。獲取和研究外泌體所需的一切，從分離和鑒定分析以及染色等。基于qPCR的外泌體miRNA分析還是RNA-Seq方法，我們都有高質(zhì)量的外泌體研究產(chǎn)品來支持您的科學(xué)研究并推進(jìn)您的工作。

 

外泌體是什么？

外泌體(Exosome)是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜合后，釋放到細(xì)胞外的一種直徑約30-150nm的膜性囊泡，區(qū)別于微囊泡（100-1000nm),凋亡小體（400-4000nm）。

目前學(xué)術(shù)界主流觀點(diǎn)認(rèn)為外泌體的產(chǎn)生過程為:細(xì)胞膜內(nèi)陷形成內(nèi)體(Endosome)，然后再形成多囊泡體(Mutivesicutar bodes，MVB)，最后分泌到細(xì)胞外成為外泌體。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可以分泌產(chǎn)生外泌體。

外泌體是細(xì)胞分泌的膜性囊泡，由磷脂雙分子及其攜帶的膜性分子組成，其主要成分為蛋白質(zhì)、酶、mRNA、miRNA、DNA片段和脂質(zhì)等。

 

性質(zhì)分類	外泌體 Exosomes	微囊泡 Microvesicles	凋亡小體 Apoptotic Bodies
直徑	30-150 nm	100-1000 nm	400-4000 nm
密度(g/mL)	1.10-1.18	1.02-1.22	1.16-1.28
蛋白標(biāo)記物	Alix、TSG101、HSC70、CD63、CD81、CD9	Selectin、Integrins、CD40、MMP	Histones
來源	細(xì)胞內(nèi)的多泡小體與細(xì)胞膜融合后，其內(nèi)的小泡釋放到細(xì)胞外	細(xì)胞膜出芽形成	凋亡時(shí)細(xì)胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)形成的泡狀小體
攜帶遺傳信息	mRNA、miRNA、DNA	mRNA、miRNA、DNA	mRNA、miRNA、DNA
功能	胞內(nèi)信息傳遞，胞外物質(zhì)交換	胞內(nèi)信息傳遞，胞間遺傳物質(zhì)運(yùn)輸	調(diào)理病理學(xué)及生理發(fā)生過程

 

外泌體研究應(yīng)用

• 載體藥物研究：外泌體可作為載體將包裹在內(nèi)的藥物運(yùn)送到目標(biāo)區(qū)域，做到靶向治療；
• 診斷研究：主要研究外泌體的種類、數(shù)目、大小和內(nèi)容物與疾病之間的關(guān)系，來預(yù)測疾病的發(fā)生與進(jìn)展（如阿爾茲海默癥）；
• 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體改造：間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與間充質(zhì)干細(xì)胞有著相似的功能，間充質(zhì)干細(xì)胞來源更穩(wěn)定，更好保存，易于管理和控制，可以人為改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量；
• 外泌體biomarker：外泌體內(nèi)容物分析轉(zhuǎn)錄組測序、芯片（mRNA、LncRNA、miRNA，cirRNA）、蛋白質(zhì)組、代謝組分析。

 

外泌體的科研思路

對(duì)外泌體進(jìn)行提取以后，通常對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定，方法為：NTA粒徑分析、電鏡掃描和Western Blot，WB中的常見指標(biāo)有CD9, CD63, CD81、TSG101，后續(xù)科研思路比較廣泛，其中外泌體內(nèi)含RNA表達(dá)譜研究二代測序的研究是熱門的科學(xué)研究方向，下圖為常見的科研思路的整理圖：

外泌體的提取

翌圣生物經(jīng)過研發(fā)，開發(fā)出獨(dú)特的分離技術(shù)，可以快速從各種樣本中如血漿/血清，細(xì)胞培養(yǎng)上清，尿液，乳液，腹水，羊水，唾液等其他體液中獲得大量完整的外泌體，適用于下游共培養(yǎng)，電鏡分析和高通量測序等實(shí)驗(yàn)。

 

翌圣外泌體提取試劑盒核心優(yōu)勢(shì)

• 涵蓋細(xì)胞上清、組織、尿液、血清血漿、乳液等；
• 樣品處理量大、可達(dá)同類產(chǎn)品5倍以上；
• 外泌體可用于細(xì)胞共孵育和組學(xué)研究；
• 專注外泌體試劑盒研發(fā)持續(xù)優(yōu)化。

 

翌圣外泌體提取試劑盒選購指南

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格	選購指南
41205ES	Hieff® Quick Exosome Isolation Kit Plus (for Cell Culture Media) 細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體快速抽提試劑盒Plus	20 T	3739	適用于細(xì)胞上清(尿液)，可以提取40 mL細(xì)胞上清液
41206ES	Hieff® Quick Exosome Isolation Kit Plus(for Serum/Plasma) 血清/血漿外泌體快速提取分離試劑盒Plus	30 T	3155	適用于血清血漿，可以提取30 mL
41216ES	Hieff® high purity exosome isolation kit（for Serum/Plasma） 高純度血清/血漿外泌體快速抽提試劑盒	20 T	3775	適用于血清血漿(血漿優(yōu)先選該試劑盒)，可以提取2 mL，為41206ES升級(jí)版
41207ES	Hieff® Quick Exosome Isolation Kit Plus (for Urine) 尿液外泌體快速抽提試劑盒Plus	20 T	3755	適用于尿液，提議提取500 mL
41208ES	Hieff® Quick Exosome Isolation Kit Plus(for Body Fluids) 體液外泌體快速提取分離試劑盒Plus	30 T	3755	適用于體液，提議提取60 mL
41209ES	Hieff® Quick Exosome Isolation Kit Plus(for Milk) 乳液外泌體快速提取分離試劑盒Plus	20 T	4255	適用于牛奶、羊奶、馬奶、駝奶等400-500 mL的初始乳液
41212ES	Exosome Purification Column 外泌體純化柱	10T/20T /30T	849/1255 /1779	試劑盒配套純化柱

 

外泌體的鑒定三件套

• 電鏡檢測：通過TEM透射電鏡看清外泌體形態(tài)；
• 粒徑檢測：通過NTA，看外泌體顆粒大小及分布；
• Western Blot檢測：WB分析典型的標(biāo)記蛋白包括四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81等，定性鑒定檢測需要選擇至少2個(gè)指標(biāo)才能達(dá)到文章發(fā)表要求，比如檢測CD63和TSG101。外泌體鑒定試劑盒（貨號(hào)：41203ES05 ）是翌圣生物針對(duì)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101檢測而研發(fā)的一款高效且方便的產(chǎn)品。試劑盒內(nèi)的抗體經(jīng)過嚴(yán)格篩選而得，適用于外泌體CD63和TSG101蛋白的檢測。該產(chǎn)品適用于人、大鼠、小鼠外泌體的鑒定。

 

翌圣外泌體鑒定相關(guān)產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
41203ES	Exosome identification kit for Westernblot 外泌體鑒定試劑盒	5 T	3485
40217ES	Exosome CD81 Protein Assay Kit 外泌體CD81蛋白檢測試劑盒	5 T	599
31293ES	Calnexin Rabbit pAb	50 μL/100 μL	1185/2285
30039ES	CD9 Rabbit pAb	50 μL/100 μL	1185/2285
31514ES	CD9 Rabbit mAb	50 μL/100 μL	1285/1985
30009ES	CD63 Rabbit pAb	50 μL/100 μL	1185/2285
31513ES	CD63 Rabbit mAb	50 μL/100 μL	1285/1985
31428ES	CD81 Rabbit mAb	50 μL/100 μL	1285/1985
30011ES	Hsp70 1A Mouse mAb	50 μL/100 μL	1285/1985
30010ES	TSG101 Rabbit pAb	50 μL/100 μL	1185/2285
31512ES	TSG101 Rabbit mAb	50 μL/100 μL	1285/1985

 

外泌體的示蹤

通過對(duì)外泌體體外熒光標(biāo)記示蹤，可以對(duì)外泌體功能性進(jìn)行研究，包括蛋白組學(xué)研究、外泌體活體成像實(shí)驗(yàn)、外泌體啟動(dòng)子活性研究等。目前熒光標(biāo)記外泌體的方法有很多，主要包括親脂性染料PKH-67/PKH-26、親脂性羰花青染料DiI/DiD/DiO/DiR、以及滲透型的化合物標(biāo)記法：CFSE/CFDA/Calcein-AM等。

 

翌圣外泌體示蹤相關(guān)產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
40780ES	Hieff® exosome tracker kit (for red fluorescence) 外泌體紅色熒光示蹤試劑盒	20 μL	1855
40781ES	Hieff® exosome tracker kit(for green fluorescence) 外泌體綠色熒光示蹤試劑盒	20 μL	1855
40726ES	DiI (DiIC18(3)) 細(xì)胞膜橙紅色熒光探針	10mg	3739
40725ES	DiO (DiOC18(3)) 細(xì)胞膜綠色熒光探針	10mg/25mg	3155
40758ES	DiD Perchlorate (DiIC18(5)) 細(xì)胞膜紅色熒光探針	25mg	3775
40757ES	DiR Iodide (DiIC18(7)) 細(xì)胞膜深紅色熒光探針	25mg	3755

 

高純度外泌體

隨著應(yīng)用型客戶對(duì)于外泌體純度要求的提高，翌圣生物基于大規(guī)模外泌體分泌純化工藝平臺(tái)，經(jīng)過數(shù)十項(xiàng)質(zhì)量控制，推出高純度外泌體產(chǎn)品，其中包括293T外泌體，牛奶外泌體等。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

• 樣本來源清晰可追溯；
• 無血清培養(yǎng)，排除外泌體干擾；
• 純度高：經(jīng)多種工藝分離純化制備；
• 適用范圍廣，結(jié)果可靠穩(wěn)定；

產(chǎn)品應(yīng)用

• 作為標(biāo)準(zhǔn)外泌體顆粒，可應(yīng)用于流式細(xì)胞檢測、蛋白質(zhì)印跡、外泌體成像等研究使用；
• 作為采用外泌體的核酸和蛋白質(zhì)生物標(biāo)記研究的標(biāo)準(zhǔn)品；
• 作為體外和體內(nèi)生物學(xué)功能研究的對(duì)照外泌體；

高純度外泌體產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
41219ES	293T Cell Exosome  293T細(xì)胞外泌體	100 μg	3499
41220ES	MSC Cell Exosomes (Human)  MSC細(xì)胞外泌體（人）	100 μg	4199
41221ES	NK Cell Exosomes (Human)   NK細(xì)胞外泌體（人）	100 μg	4199
41222ES	Milk Exosome  牛奶外泌體	20 mg/100 mg	3499/11999

 

外泌體專用培養(yǎng)基

本產(chǎn)品是針對(duì)外泌體開發(fā)的一種培養(yǎng)基，產(chǎn)品主要成分為HEPES, L-Glutamine,  Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose. 無動(dòng)物源Xeno-free, Serum-free，不含生長因子（Growth factors），細(xì)胞培養(yǎng)過程中無需添加血清即可達(dá)到完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)狀態(tài)，有利于外泌體的收獲。

數(shù)據(jù)展示

 

外泌體培養(yǎng)基產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格	適用范圍
41210ES	Hieff® Serum-free Medium(for Exosome) 外泌體專用無血清培養(yǎng)基	50 mL/500 mL	229/1939	適用細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞系及T細(xì)胞
41213ES	Hieff® Exosome Serum-free Medium （for MSC） 外泌體無血清培養(yǎng)基（間充質(zhì)干細(xì)胞專用）	50 mL/500 mL	519/3079	適用細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞專用

 

外泌體研究常見問題

1.不同樣本提取注意事項(xiàng)

（1）細(xì)胞培養(yǎng)上清：細(xì)胞培養(yǎng)過程中需注意污染、培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞死亡率及血清的問題；

（2）血液：需區(qū)分血漿與血清采血針的大小和采血時(shí)間；

（3）尿液：需注意個(gè)體年齡、性別、進(jìn)食情況和新鮮度；

（4）唾液：需注意取樣位置和取樣時(shí)間，舌下腺、頜下腺、腮腺；

（5）乳汁：泌乳的階段、胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂養(yǎng)、母親的健康狀態(tài)、精神狀態(tài)等都會(huì)影響外泌體的分泌；

（6）腦脊液：樣本的獲取量少，樣本中外泌體豐度低。

2.如何獲得高質(zhì)量的細(xì)胞上清液外泌體？

（1）細(xì)胞培養(yǎng)的原則：

1. 降低血清的使用量；
2. 使用去外泌體血清；
3. 使用無血清培養(yǎng)基替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
4. 注意支原體的污染。

（2）細(xì)胞上清液預(yù)處理原則：

1. 通過差速離心，依次去除細(xì)胞顆粒、細(xì)胞碎片；
2. 也可通過0.45 μm的濾器過濾處理。

（3）細(xì)胞上清液的初步濃縮原則

1. 針對(duì)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等外泌體分泌量少的細(xì)胞樣品；
2. 可以使用10~100 KD之間的超濾管濃縮，濃縮倍數(shù)2~5倍。

（4）針對(duì)細(xì)胞上清液的外泌體提取原則：超離法、試劑盒法均可。

3.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，如何去除血清來源的外泌體？

多數(shù)情況下，細(xì)胞在體外培養(yǎng)需要血清，而血清中一般都含有外泌體，為避免血清對(duì)細(xì)胞外泌體的污染，可采用以下幾種方法：

（1）將細(xì)胞培養(yǎng)用的血清通過1×10⁵ g超速離心16 h以去除血清外泌體；

（2）選擇無血清專用培養(yǎng)基(41210ES-Hieff® Serum-free Medium(for Exosome) 外泌體專用無血清培養(yǎng)基)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

（3）選擇去除外泌體血清進(jìn)行培養(yǎng)。

4.無外泌體血清培養(yǎng)基(或者無血清專用培養(yǎng)基)在什么時(shí)候使用？

細(xì)胞在正常含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞融合度約為60%~70%時(shí)，移去原有含血清的培養(yǎng)基，換成新鮮的無外泌體血清培養(yǎng)基(或者無血清專用培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24~48h，細(xì)胞融合度達(dá)到80%~95%左右時(shí)收取上清，該上清液即可用于提取外泌體。必須確保細(xì)胞可以正常生長/增殖。

5.細(xì)胞培養(yǎng)過程中的死細(xì)胞是否會(huì)影響外泌體的提??？

會(huì)的。在收獲細(xì)胞時(shí)，應(yīng)確定死亡細(xì)胞占比不超過5%。細(xì)胞凋亡/死亡過程中會(huì)釋放大量大小不等的囊泡，它們?cè)谕饷隗w的提取純化過程中會(huì)污染活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體。

6.超離后的外泌體如何進(jìn)行除菌操作？

超速離心是個(gè)多步驟操作的實(shí)驗(yàn)，中間操作可能會(huì)帶來細(xì)菌的污染，后期如果進(jìn)行細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，則除菌步驟則必不可少。

針對(duì)大量的外泌體，可用0.2 μm過濾器，適合1 mL以上的液體過濾；少量的外泌體，可用離心過濾柱(翌圣貨號(hào)：41212ES)，適用0.5 mL以下的液體過濾。

7.外泌體的保存

雖然外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能很好的保護(hù)其包被的物質(zhì)，但是分離獲得的外泌體仍然需要低溫保存。短期保存(一周之內(nèi))，4℃；長期保存，如果樣品量較大，建議分裝后保存于-20℃或-80℃冰箱。

8.外泌體檢測時(shí)的直標(biāo)蛋白有哪些？

頻率最高的指標(biāo)：CD63、TSG101、CD9和CD81；

常見指標(biāo)：Alix、HSP70、flotillin和Syntenin；

其它指標(biāo)：HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT等。

9.常見樣品可以提取到多少外泌體？

樣品類型	樣本體積	NTA顆粒數(shù) Particles/mL	粒徑分布 nm	蛋白量 μg	RNA ng
細(xì)胞上清*	1 mL	108~109	90~130	1~2	0.1~0.4
血清/血漿	1 mL	1010~1011	60~100	400~500	5~10

備注：細(xì)胞上清為常見腫瘤細(xì)胞

10.外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)檢測需要多少的樣本量？

蛋白質(zhì)組學(xué)檢測需要準(zhǔn)備200 μg的總蛋白。

11.外泌體熒光標(biāo)記需要注意什么？

（1）無論通過哪種染料進(jìn)行外泌體熒光標(biāo)記，都需要在標(biāo)記后去除溶液中的多余染料；

（2）簡便的方法就是針對(duì)標(biāo)記好后的外泌體重新再做一次外泌體的提取操作。