越來越多的神經(jīng)類疾病未被攻克，威脅著人類的健康，所以認識大腦的全部功能并能治療各種神經(jīng)類疾病是每個神經(jīng)類科研工作者致力的方向。涉及現(xiàn)實和倫理方面的限制，想要獲取實驗使用的腦組織存在困難，傳統(tǒng)上常使用某些多如嚙齒類動物作為模式生物，用于神經(jīng)科學的研究。但是，人和嚙齒類動物的腦組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育相似度并不是很高，因此在體外培養(yǎng)腦類器官是一件非常急需解決的問題。
科研人員可以通過分化人多能干細胞（hPSCs），包括誘導多能干細胞（ips）和胚胎干細胞（ES），來獲取神經(jīng)細胞，在體外模擬人的環(huán)境，培養(yǎng)出腦類器官，有利于研究者發(fā)展治療手段，從而治愈疾病。
研究團隊開發(fā)了一種將人類多能干細胞分化為表達人類中腦特征標志物的神經(jīng)元細胞層的方法，將患者的皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs，然后置于添加FGF-basic（堿性成纖維細胞因子）、CHIR-99021，MEK抑制劑（PD0325901）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
DMEM/F12的神經(jīng)元誘導培養(yǎng)基：神經(jīng)基礎、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制劑Y-27632、0.1% β-巰基乙醇、1 μg/mL肝素。前48 h加入Y-27632，第2天改變神經(jīng)元誘導培養(yǎng)基。
3天后，hMLOs開始擠壓神經(jīng)外胚層芽。此時，培養(yǎng)基被完全移除，并立即使用配備預冷200 μL移液管尖端的移液管向每個孔中加入30 μL還原生長因子基質(zhì)凝膠。將基質(zhì)嵌入的中腦類器官放入37°C培養(yǎng)箱30 min，使基質(zhì)凝固。
生長在組織生長誘導培養(yǎng)基中含有神經(jīng)基礎培養(yǎng)基，1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、0.1% β巰基乙醇、2.5 μg/mL胰島素、200 ng/mL層粘連蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。
分化培養(yǎng)基，包括神經(jīng)基礎培養(yǎng)基、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、100 μM抗壞血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β巰基乙醇、10 ng/mL BDNF，10 ng/mL GDNF。培養(yǎng)基中加入了雙抗，以防止長期培養(yǎng)過程中潛在的細菌污染。每3天更換一次培養(yǎng)基。[1]
圖1.人中腦樣類器官每個階段細胞的典型形態(tài)（SBNC：SB-431542、CHIR-99021、Noggin）[1]
圖2.神經(jīng)元免疫染色[1]
額顳葉癡呆是一種非常嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，會導致患者的行為、言語和思考出現(xiàn)問題。已知tau蛋白的突變和該疾病息息相關，但是具體的作用機制并不十分清楚。因此，研究團隊利用人源誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）在體外構(gòu)建了額顳葉癡呆的大部分損傷的大腦類器官模型，表達tau突變蛋白，從而揭示神經(jīng)元損傷的早期的分子水平變化，闡述致病機理，并發(fā)現(xiàn)一種藥物Apilimod能抑制神經(jīng)元的死亡。
球形形成培養(yǎng)基（SFM）：E8培養(yǎng)基和10 mM ROCK抑制劑Y-27632組成。
分化培養(yǎng)基由E6培養(yǎng)基添加2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；每個球狀體添加1 mL培養(yǎng)基。將球狀體輕輕混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小時。
每天從培養(yǎng)皿中輕輕吸出培養(yǎng)基，用分化培養(yǎng)基替換，從第2天到第5天實現(xiàn)65%培養(yǎng)基交換。第6天，將培養(yǎng)基改為神經(jīng)培養(yǎng)基（NM），包括神經(jīng)基底、B27去除維生素A、谷氨酸和抗A，并添加20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF2。
第25天，每隔一天用NM補充20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3（培養(yǎng)基C），補充65%培養(yǎng)基。從第43天開始，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，不添加生長因子，每個培養(yǎng)皿更換15-20 mL，75%培養(yǎng)基更換。在整個培養(yǎng)期間，融合在一起的類器官被一次性手術(shù)刀切割分開。在下圖的實驗中，誘導多能干細胞被生長和模式化。[2]
圖3.腦類器官中神經(jīng)元存活的縱向軸[2]
圖4. 5 mM谷氨酸處理tau-V337M和等位基因V337V類器官圖像[2]
圖5.5 mM谷氨酸鹽和DMSO處理tau-V337M類器官圖像[2]
圖6.apilimod可逆轉(zhuǎn)tau-V337M類器官對谷氨酸興奮毒性的敏感性[2]
人類大腦發(fā)育表現(xiàn)出幾個獨特的方面，如復雜性的增加和神經(jīng)元輸出的擴大，已被證明很難在模式生物中進行研究。因此，體外方法模擬人類大腦發(fā)育和疾病是一個熱門的研究領域。
在這里，研究團隊建立了類腦器官培養(yǎng)模型，能模仿內(nèi)源性發(fā)育程序，該模型能在標準組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，在1~2個月內(nèi)即可發(fā)育出大腦皮層、腹側(cè)端腦、視網(wǎng)膜等。這個方案可以應用于發(fā)育研究以及各種人類大腦疾病的研究。
此外，由于類器官可以在長期培養(yǎng)中維持一年以上，它們也有可能模擬后期事件，如神經(jīng)元成熟和存活。
人多能干細胞產(chǎn)生大腦類器官：添加L-alanyl-L-glutamine solution、ROCK抑制劑Y-27632、N-2 supplement、B27去除維生素A、B27+vitA supplement、Penicillin-Streptomycin、bFGF等。[3]
圖7.人PSCs腦類器官發(fā)育的進展[3]
腦類器官培養(yǎng)添加的化合物匯總：
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化合物名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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L-glutamine |
100 g |
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B-27 supplement without vitamin A |
10 mL |
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B-27 supplement,serum free,50X |
10 mL |
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N-2 supplement |
5 mL |
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L-alanyl-L-glutamine solution,200mM |
100 mL/1 L |
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MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA），100X |
100 mL |
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Penicillin-streptomycin |
100 mL |
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SB-431542 |
5/10/50 mg |
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XAV-939 |
10/25 mg |
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Y-27632 |
1/5/10 mg |
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Y-27632 dihydrochloride |
5/10/25 mg |
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CHIR-99021 |
2/5/10 mg |
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Dorsomorphin (Compound C) |
5/25 mg |
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PD0325901(Mirdametinib) |
5/10/50 mg |
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L-Ascorbic acid L-抗壞血酸 |
1/5 g |
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DBcAMP |
50/100 mg |
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Nimodipine |
100/500 mg |
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MK-801 maleate |
54013ES |
10/50 mg |
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Apilimod A |
54012ES |
5/25 mg |
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CNQX |
54014ES |
5/25 mg |
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L-Glutamic acid monosodium salt hydrate |
54015ES |
100 mg |
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human BDNF |
5/20/100/500 μg/1 mg |
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| Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠 | 40191ES08/10 | 5mL/10mL |
[1] Jo J, et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 2016 Aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27476966; PMCID: PMC5510242.
[2] Bowles K R, et al. ELAVL4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in MAPT mutation cerebral organoids[J]. Cell, 2021(Suppl 5).
[3] Lancaster M A, Knoblich J A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[J]. Nature protocols erecipes for researchers, 2014.
