細胞凋亡（Apoptosis）是細胞程序性死亡（Programmed cell death）的一種,由基因嚴格控制，對于控制細胞生長，發(fā)育和更新至關(guān)重要。細胞凋亡的激活主要是由兩種途徑，一種是內(nèi)源性的由細胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)或是內(nèi)部凋亡信號引起線粒體釋放細胞色素C（Cytochrome C），激活Caspase家族誘發(fā)細胞凋亡；另一種是外源性的由細胞表面的受體接收凋亡信號后激活Caspase家族從而誘發(fā)細胞凋亡?？砂ㄒ幌盗刑卣餍宰兓?，如細胞皺縮、核固縮、核碎裂、凋亡小體形成等形態(tài)學變化以及DNA特征性片段化、新基因表達、某些生物大分子合成等生物化學變化。
圖1：細胞凋亡過程（From Wikipedia）
細胞凋亡的檢測方法正是基于凋亡細胞特殊的形態(tài)學改變和生物化學變化而設(shè)計的。
細胞發(fā)生凋亡時會出現(xiàn)一系列獨特的形態(tài)學變化：
1） 細胞體積變小
2） 核固縮，核仁碎裂，染色質(zhì)密度增高
3） 胞質(zhì)濃縮，細胞器密度增高
4） 細胞膜皺褶、卷曲、內(nèi)陷，并將胞質(zhì)和DNA分割包裹形成凋亡小體
因此可以利用電鏡成像進行凋亡鑒定。
圖2. 1：對照組細胞，2-6：分別用不同濃度DHA誘導凋亡后的細胞狀態(tài)[1]
細胞發(fā)生凋亡時，Caspase會激活Caspase-Activated DNase(CAD)，將DNA降解形成長度為180-200bp或其整倍數(shù)的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后會形成大小不一的條帶。
活細胞DNA：不斷裂，凝膠電泳為一正常條帶
壞死細胞DNA：隨機斷裂，凝膠電泳表現(xiàn)為彌漫連續(xù)模糊的條帶
凋亡細胞DNA：等腰梯形條帶
圖3. 泳道2：正常細胞DNA；泳道6：凋亡細胞DNA
細胞凋亡形成的DNA斷裂會暴露DNA鏈的3’-OH末端，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）可催化斷裂DNA的3′-OH端的核酸聚合反應(yīng)，加入帶有熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標記的dUTP，顯色反應(yīng)后可特異地進行原位凋亡細胞的檢測。正?；蛟鲋臣毎麕缀鯖]有 DNA的斷裂，故很少被染色。
圖4. YEASEN TUNEL-FITC試劑盒（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40306）檢測凋亡細胞樣本
正常細胞中，細胞膜上的磷酯酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞質(zhì)一側(cè)，細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸從細胞膜胞質(zhì)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外表面。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，可與外翻的PS特異性結(jié)合，用Annexin V（熒光素或生物素標記）作為熒光探針，并與PI同時使用，借助FCM分析染色情況，其中Annexin V-／PI-、Annexin V+／PI+、Annexin V+／PI-、Annexin V-／PI+分別表示正常、晚期凋亡或壞死、早期凋亡和機械性損傷的細胞。
圖5. YEASEN Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（點擊查看產(chǎn)品:CAT.40302）檢測細胞凋亡
處于凋亡早期的細胞，在顯微鏡下還未出現(xiàn)顯著變化時，細胞內(nèi)線粒體膜電位已經(jīng)開始改變：線粒體膜通透性增加，跨膜電位下降。膜電位下降被認為是凋亡最早的生物學變化，如果膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。一些親脂陽離子熒光染料，如羅丹明123、JC-1等可與線粒體基質(zhì)緊密結(jié)合，線粒體膜電位下降程度和線粒體聚集染料能力下降程度呈現(xiàn)正相關(guān)。
圖6. YEASEN JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40706）檢測膜電位變化[3]
細胞的生命活動都離不開 Ca2+ ，Ca2+超載時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，細胞內(nèi)外Ca2+平衡被破壞，導致細胞凋亡。用 Ca2+特異性熒光探針，如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等對細胞進行標記后，再用 FCM 或熒光、共聚焦激光顯微鏡檢測，可以準確地得出細胞凋亡的生理指標。
圖7. YEASEN Fluo-4， AM，細胞膜可滲透鈣離子熒光探針（點擊查看產(chǎn)品：CAT.40704）[4]
胱天蛋白酶（caspase）活性檢測
caspase-3 被認為是各種因素導致凋亡的關(guān)鍵酶，生理狀態(tài)下它以酶原的形式存在，它的活化預示著細胞執(zhí)行凋亡程序的開始，是凋亡進入不可逆階段的標志。目前，壞死細胞中尚未發(fā)現(xiàn)有caspase-3 的活化，因此，通過檢測 caspase-3 活力強弱可判斷細胞是否凋亡或壞死。一般有檢測含量和檢測活性兩種。檢測含量是用Western blot、免疫組化或免疫熒光的方法進行Caspase定量或相對定量。檢測活性則是利用熒光素偶聯(lián)的可被Caspase特異性識別的短肽，在Caspase切割短肽后，熒光素會被釋放出來，可以根據(jù)熒光強度判斷Caspase活性。
細胞凋亡時某些基因表達異常產(chǎn)物，這些基因轉(zhuǎn)錄翻譯出來的產(chǎn)物可促進或抑制細胞凋亡，如細胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及 Fas等。這些相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的測定可為細胞凋亡檢測提供依據(jù)。
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產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
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40302ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40303ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40304ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40305ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40306ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40307ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40308ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40310ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40706ES60 |
100T |
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40752ES60 |
100T |
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40273ES25/60 |
25T/100T |
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40775/40776/40702/40703/40704 |
50ug/5*50ug/1mg |
[1]李媛媛, 吳洪娟. 雙氫青蒿素體外誘導人乳腺癌細胞凋亡的電鏡研究[J]. 電子顯微學報, 2015(02):138-141.
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